«Липазная концепция» лечения туберкулеза

Существует мнение, что неудачи в лечении туберкулеза человека в значительной мере обусловлены часто и быстро возникающей устойчивостью микобактерий туберкулеза МБТ к лекарственным препаратам.

В литературе уже давно обсуждаются, хотя и не весьма убедительные данные об использовании в медицине, в том числе для лечения туберкулеза, препаратов из насекомых, в частности, из восковой моли [93,94].

Восковая моль, Galleria mellonella L получила свое название за чрезвычайно редкую способность переваривать и усваивать пчелиный воск,

благодаря специфическим липолитическим ферментам. Уже несколько веков спиртовой экстракт восковой моли используется в народной медицине как средство для лечения и профилактики туберкулеза. На протяжении первой половины XX века периодически публиковались экспериментальные данные об ингибирующем воздействии экстрактов из восковой моли на микобактерии.

На протяжении первой половины XX века периодически публиковались экспериментальные данные об ингибирующем действии экстрактов из восковой моли на клетки микобактерий.

Первым о возможности использования липаз во фтизиатрии высказался Мечников И.И. [96,97]. Ученый стремился получить противотуберкулезную вакцину. Его идея основывалась на том, что пищеварительные ферменты насекомого, питающегося пчелиным воском, могут разрушить восковую оболочку туберкулезных бактерий. Предполагаемым противотуберкулезным механизмом действия «липолитических» ферментов восковой моли является разрушение некоторых жизненно важных для микобактерий липидов и других содержащих сложноэфирные связи видоспецифических молекул, что могло бы привести к гибели бактерий или к повреждению липидного слоя клеточной стенки, делая бактерии более уязвимыми для лекарственных препаратов.

В серии работ Метальникова С.И., начиная с 1901 г. микроскопическим исследованием было обнаружено, что при контакте содержащих фагоциты грубых экстрактов и гемолимфы личинок восковой моли с микобактериями происходит быстрое «переваривание» микобактерий, внешне идентичное естественному для моли процессу «переваривания» пчелиного воска. Позднее Fiessinger N. и Gajdos А. [97] показали наличие липидолитической активности (при тестировании с трибутиратом, не с микобактериями) в глицериновых экстрактах из

личинок восковой моли. Н. Olivier обнаружил «антибиотическое действие» на микобактерии ацетонового экстракта из личинок, выявленное при морфологическом изучении микобактерий. В работах Mankiewicz Е. [98] было показано, что экстракты из гомогената личинок восковой моли, предварительно обработанные ацетоном, обладают по отношению к взвеси микобактерий высокой липидолитической активностью, определяемой кондуктометрическим титрованием освобождающихся при гидролизе жирных кислот. Однако не было выявлено самих ферментов и не было доказано, что действовали именно они, лечебный эффект не изучался на предварительно инфицированных животных.

В результате анализа ранее опубликованных и новых данных, Анненковым Г.А. и др. [97,101] была предложена «липазная концепция» лечения туберкулеза как один из возможных подходов к созданию противотуберкулезных препаратов нового типа.

Для рода микобактерий (включающего несколько десятков видов) характерно необычайно высокое содержание липидов - до 40-60% веса, тогда как в клетках других прокариотов их обычно не более 5% [102-105]. В состав липидов микобактерий входит довольно много широко распространенных в природе прямоцепочечных предельных и непредельных жирных кислот с числом углеродных атомов от 12 до 30, чаще связанных, в том числе в виде ацилглицеридов.

Существенную часть липидов M.tuberculosis составляют чрезвычайно вариабильные по строению крупные молекулы специфических липидов, среди которых выделяются миколовые кислоты. Они представляют собой

длинноцепочечные жирные кислоты (до 60-80 и более углеродных атомов), нередко разветвленные. В клетках МБТ содержатся также полиморфные фосфолипиды, сульфолипиды и другие соединения, относимые к липидам.

В контексте «липазной концепции», молекулярным механизмом необратимого повреждения или, в лучшем варианте, разрушения МБТ должен стать ферментативный гидролиз критического количества жизненно важных для МБТ сложных липидных молекул, что вело бы непосредственно к гибели этих клеток, либо вначале к повреждению их защитного липидного слоя. В результате чего бактерии становились бы более доступными для факторов иммунитета макроорганизма и/или для лекарственных препаратов.

1.6. Антибактериальная активность хитозана

Согласно литературным данным, хитин и хитозан обладают антибактериальными свойствами в отношении многих микроорганизмов [106,107], микроскопических грибов [31,108,109], вирусов [ПО], а так же в отношении некоторых штаммов дрожжей [111].

Уровень антибактериальной активности хитозана зависит от вида микроорганизма, размера молекул хитозана, концентрации препарата в растворе, pH, температуры, источников хитина и хитозана, типа модификации [106,112-115].

Помимо этого, антибактериальное действие хитоолигосахаридов сильно зависит от СД и СП, то есть Мц, и для его проявления необходимы олигомеры глюкозамина со СП не менее 6 [116]. В свою очередь величина СД и Мд хитозана зависят от условий их получения. Хитозаны с низкой СП и с высокой СД наиболее эффективны как антибактериальные агенты [117].

Известно, что клеточная стенка грамположительных бактерий состоит из толстого пептидогликанового слоя, располагающегося с наружной стороны клеточной мембраны. Пептидогликаны построены из

повторяющихся звеньев: GlcNAc и N-ацетилмурамовой кислоты. Кроме того, молекула пептидогликана содержит остатки тейхоевой кислоты [П8], в состав которой входят повторяющиеся звенья глицерина и адонита. Поскольку звенья тейхоевой кислоты, соединенные с D-аланином пептидогликана через фосфатный мостик, несут отрицательный заряд, то их наличием, отчасти, объясняется отрицательный заряд поверхности клетки в целом. Клеточная стенка грамотрицательных бактерий состоит из тонкого слоя пептидогликанов и фосфолипидного двойного слоя с наружной стороны клеточной мембраны [119]. Присоединенные к наружному фосфолипидному двойному слою липиды, и полисахариды образуют специфические липополисахаридные структуры. Так как этот наружный фосфолипидный слой имеет гидрофильную фосфатную группу, несущую отрицательный заряд, клеточная поверхность любой грамотрицательной бактерии в целом оказывается заряженной отрицательно. Таким образом, поверхность клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов имеет отрицательный заряд.

Протонированные NH₂ группы хитозана способны взаимодействовать с анионными группами поверхности клетки и за счет электростатических и ионных взаимодействий формировать полиэлектролитные комплексы с компонентами бактериальной поверхности [120]. Количество положительно заряженных NH₂ групп хитозана увеличивается с увеличением СД.

зависит от плотности заряда (конформации цепей), соотношения времени их взаимодействия и температуры [122].

В большинстве работ, посвященных исследованию антибактериальных свойств хитозана, изучаются высокомолекулярные производные [125,126]. Исследование антибактериальной активности растворов хитозана с Мц 160кДа в концентрации 0,5% против Е. coli и 5. aureus, показало, что для проявления антибактериального эффекта в отношении Е. coli было достаточно концентрации 0,0375%. МИК для Е. coli и S. aureus составила 0,375 мг/мл и 0,15 мг/мл, соответственно [127].

Однако в основном используют хитозан, растворенный в уксусной или соляной кислоте [125,126]. Например, Tsai G.-J. [122] и Червинец В.М. [128] показали, что 1%-ные растворы хитозанов с Мц 26-600 кДа и СД 75- 85%, в 0,2%-ной соляной кислоте, оказывают антимикробное действие на многие микроорганизмы. Однако следует отметить, что применение в качестве растворителя хитозана кислот само по себе вызывает гибель исследуемых микроорганизмов [122,128], что искажает истинные показатели выживаемости клеток при их обработке хитозаном [129].

Важным абиотическим фактором, влияющим на активность хитозана, является pH [31]. При pH ниже 6 аминогруппы при С-2 глюкозаминных остатках молекулы хитозана лучше взаимодействуют с отрицательно заряженной поверхностью бактериальной клетки [122,130]. Вместе с тем известно, что антибактериальная активность ограничивается плохой растворимостью хитозана при pH более 6,5 [112].

Изучение влияния значений pH на степень антибактериального воздействия хитозана показали, что в кислых условиях (pH 5,8) антибактериальная активность была максимальной при низкой концентрации препарата.

антибактериальный эффект увеличивается с увеличением температуры и уменьшением pH (130). Дело в том, что при pH 5,3-5,5 хитозан протонирован. При таком значении pH карбоксильные и фосфатные группы поверхности бактерий несут отрицательный заряд, вследствие чего возникает возможность их электростатического связывания с хитозаном. При нейтральном pH хитозан протонирован намного меньше (рК_к 6,3) и его связывание с внешней мембраной клетки менее вероятно [120].

Было показано, что при низких концентрациях хитозан соединяется с поверхностью клеточной стенки, разрушает клеточную мембрану и вызывает гибель клетки с вытеканием наружу внутреннего содержимого клетки [112]. При высоких концентрациях хитозан связывается с поверхностью клеточной стенки, но препятствует вытеканию внутриклеточных компонентов [107]. Meyer Н. с соавторами [131] использовали хитозаны в концентрации 0,5-2,5% при pH 5,5 против Streptomyces aureus, Е. coli, Yersinia enterocolitica, Listeria monocytogenes и Salmonella typhimurium. Исследуемые образцы при данной концентрации вызывали гибель всех вышеперечисленных микроорганизмов. Однако хитозан в концентрации менее 1% не влиял на рост S. aureus, Pseudomonas aeruginosa и Candida tropicalis. К сожалению, в данной работе авторы не указали значений Мц и СД исследуемых препаратов, что необходимо для полного понимания и объяснения причин гибели микроорганизмов.

Tsai G.-J. с соавторами [120] исследовали влияние СД на антибактериальную активность хитозана. Оказалось, что с увеличением СД хитозана от 53 до 98% увеличивался его антибактериальный эффект. Было изучено влияние хитозана в отношении патогенного штамма Clostridium perfringes и 13 штаммов пробиотиков, включая 7 штаммов Lactobacillus и 6 штаммов Bifidobacterium. Была обнаружена корреляция между увеличением СД хитозана от 50 до 95% и усилением антибактериального воздействия хитозана на клетки микроорганизмов.

Хитозан с СД 50% обладал меньшей активностью, чем полимер со СД 95%. Morimoto L. и Shigemasa Y. изучали ингибирование бактериального роста хитозанов с СД от 66 до 91%. В их работе так же подтвердилось, что с увеличением СД усиливается антибактериальный эффект [106]. Sekiguchi S. показал, что хитозаны с Мг| 3,1 кДа и СД 52%, и Mq 7,4кДа и СД 45% проявляли слабую антибактериальную активность против В. cereus. Процент гибели клеток составил 58% и 74%, соответственно. Активность зависела от Mq и СД образцов [117]. Myoung H.S. с соавторами [132] изучали влияние катионов на связывание низкомолекулярного хитозана (Mq 3 к Да, СД 95%) с поверхностью бактериальных клеток S. aureus и Е. coli. Клетки подвергали воздействию СаСЬ, а затем обрабатывали хитозаном. В итоге, количество хитозана, связанного с клетками, уменьшилось. Клетки & aureus обладали большим эффектом связывания с ионами Са²⁺. Этот результат показывает, что число отрицательно заряженных остатков на поверхности клетки уменьшилось, вследствие их связывания с ионами Са²⁺. Тем не менее, катионный характер не является единственным определяющим фактором антибактериальной активности хитозана [133]. В своей работе Cuero R.G. [120] показал, что мутантный штамм S. tuphimurium, имеющий на своей поверхности положительный заряд, был намного устойчивее к воздействию хитозана, чем исходный штамм. Однако электронно­микроскопические исследования показали, что хитозан, тем не менее, вызывает деформацию поверхности бактериальных клеток, а их внешняя мембрана обретает везикулярную (пористую) структуру.

Изучение времени взаимодействия хитозана и клеток бактерий показало, что процесс связывания хитозана и клеток занимает несколько минут [132]. Далее клетки подвергли воздействию детергентов (Твин 80 и Тритон Х-100) в концентрации 0,5%. Результаты показали, что на клетках S. aureus количество хитозана незначительно уменьшилось, а на клетках E.coli нет. Между тем известно, что обработка клеток EDTA и детергентами

вызывает повышение проницаемости их внешней мембраны [120]. Так, при изучении антибактериальных свойств хитозана против Е. coli в среду добавляли EDTA, что вызывало увеличение гибели клеток [113]. Тем не менее, существуют микроорганизмы, устойчивые к воздействию агентов, вызывающих проницаемость внешней мембраны - S. typhimurium, Proteus mirabilis, Bacteroides fragilis [133].

Известно, что бактерии более чувствительны к хитозану, чем грибы. Показано, что фунгицидная активность хитозана более выражена при концентрации 0,5-5,0 мг/мл и низких значениях pH (рН~6) [118,111].

Изучение антибактериальных свойств хитозан-лактатов с Мц 0,5; 5кДа и 1,2 кДа против Saccharomyces bayanus и Saccharomyces unisporus показали, что хитозан-лактат с Мц 5кДа оказывал более сильный эффект по сравнению с препаратом с Мц 0,5кДа [134]. Хитозан-лактат 1,2 кДа не обладал антибактериальными свойствами в отношении изученных микроорганизмов. Это можно объяснить тем, что антибактериальная активность хитозана уменьшается с увеличением Мц [106].

Микроскопическое исследование обработанных хитозан-лактатом клеток Sac. unisporus Y-42 показало аглютинацию хитозана на клеточной стенке микроорганизмов, что говорит о взаимодействии между хитозаном и клеточной стенкой бактерий [134]. Tsai G.J. [122] изучал антибактериальные свойства гидролизата хитозана, состоящего из низкомолекулярного хитозана 12 кДаи хитоолигосахаридов (СП 1-8). Хитозан 12 кДа проявлял высокую антибактериальную активность в концентрации 100 мкг/мл против В. cereus, Е. coli, S. aureus, Ps. aeruginosa, Salmonella enterica serovar Typhi и Saccharomyces cerevisiae в то время как хитоолигосахариды обладали существенно меньшей активностью.